如何选择流动相

如果说气血是我们身体里运行不息的精微物质，那么如同动脉一样流淌在液相色谱周身的流动相，决定着仪器各硬件的寿命。同时，它也是造成液相色谱各种问题的主要源头。今天聊一聊如何选择合适的流动相开始，为大家系统地分享流动相的相关内容。

流动相的选择

用水当选超纯水，溶剂当用色谱纯，大家都知道，在使用液相色谱仪的过程中，选择纯度高的溶剂/水，有利于实验结果和仪器保养。

1、溶剂/水纯度对HPLC分析的影响

（1）从实验方法来说，如果有机溶剂或者水的纯度差，比如含有一些有机物杂质，就会影响基线，导致基线噪音变大或者基线漂移，有一些杂质有额外的紫外吸收，会产生一些鬼峰，甚至会影响到方法的分离度。

尤其是水的使用，如果水中除了氢离子和氧离子之外，还有其它的电解质的存在，有可能会因为重金属的反应，而对色谱峰的峰形造成影响。

（2）就仪器本身而言，质量差的水或有机溶剂，还会引入一些颗粒物，堵塞色谱柱或者液相色谱仪的过滤芯，从而影响仪器性能增加维护成本。

2、有机溶剂纯度的要求

不同的有机溶剂适用不同，比如化学纯、分析纯、优级纯，这种属于通用化学试剂的纯度分类，通常用于合成制备、工业生产或者化学实验室研究类的工作；农残级、光谱纯、色谱纯，此种溶剂是根据所适用的仪器分析技术或者特殊分析领域来进行分类的。

所以我们在购买溶剂的时候一定要选择更合适液相色谱的色谱纯溶剂。

3、水的纯度的要求

这里其实比较推荐大家使用纯水仪制出来的水，因为一般实验室还是用纯水仪比较方便。在使用水的时候，我们都会用电阻率来衡量水的纯度是不是符合液相色谱的要求，比如当纯水仪制的水电阻率达到18.2MΩ才可以使用。

流动相的配制

颗粒虽微莫小觑，三个卫士需上岗

流动相的配制是我们日常实验最普通的一环，也是做实验的第一步，所以流动相配制的质量直接影响到实验的结果成功与否。

这里着重说一下影响流动相质量的过滤和脱气。

过滤，颗粒物堵塞系统对色谱分析的影响，无论是流动相还是样品，都可能会有一些颗粒物的存在，如果颗粒物被引入了液相系统，不仅损害仪器，还会影响流速的准确性、流动相的混合比例以及方法的重现性。

此时就需要启动保护流动相的三个卫士，来去除这些颗粒物和杂质。

第一个卫士：流动相过滤

滤膜的材质有多种，有些是适合过滤水相的，有些是适合过滤有机相的，也有一些可过滤有机相也可过滤水相的兼容滤膜。但大部分兼容的滤膜很容易被有机相溶解，在这里有两点需要注意：

（1）不要用过滤水的滤膜来过滤有机相，也不要过滤水相和有机相的混合流动相，如果有机相把滤膜溶解了，不但起不到过滤作用，反而会引入新的杂质，同样会堵塞系统；

（2）另外需要注意的是，若使用常规颗粒的色谱柱，使用0.45μm的滤膜即可。若使用的是UHPLC，由于色谱柱填料比常规色谱柱小很多，所以建议使用0.2μm的滤膜对流动相进行过滤。

第二个卫士：样品过滤

虽然液相色谱的进样量很少，是微升级的，但如果样品中含有颗粒物，同样会堵塞系统和色谱柱，所以样品过滤很有必要。样品过滤膜同样有专门过滤水的和过滤有机相的，也有水相、有机相兼容的滤膜。

样品过滤的建议步骤：

（1）建议注射器先吸入一点空气，这样能起到节省样品溶液的作用；

（2）将样品吸入注射器；

（3）将注射器翻转导致，擦净顶端的残留物并将样品过滤膜固定在注射器上；

（4）将溶液过滤后注入样品瓶。

第三个卫士：在线过滤器

目前有很多液相系统可以选择安装在线过滤器。在线过滤器里有一个筛板，我们将在线过滤器安装在自动进样器和色谱柱之间的流路里，增加一道防线来保护色谱柱。

脱气，流动相在使用前必须脱气，以尽可能的除去溶解在流动相中的气体。否则这些气体会使柱填料的性能降低，还能够对检测器的信号产生很大的干扰。

（1）超声波脱气

将配制好的流动相连容器放入超声水槽中脱气10～20min。这种方法比较简便，又基本上能满足日常分析操作的要求，也不影响溶剂组成。

注意：超声时应避免溶剂瓶与超声槽底部或壁接触，以免玻璃瓶破裂，容器内液面不要高出水面太多。

（2）氦气脱气

氦气缓缓的通过流动相赶去溶入的空气，如果使用得当，在10min内可除去80%～90%的溶入气体。一般说来有机溶剂中的气体易脱除，而水溶液中的气体较顽固。在溶液中吹氦是相当有效的脱气方法，这种连续脱气法在电化学检测时经常使用。

（3）真空脱气

贮液器被抽成部分真空，溶入的气体蒸发形成气泡溢出，其效果仅次于氦气脱气，现在绝大部分高效液相色谱仪都配置有在线脱气机模块。

在线脱气只适合脱完气之后的流动相，在使用过程中的微量脱气。

流动相的贮存

1、定期更换流动相，避光首选棕色瓶

流动相与仪器的管线和色谱柱直接接触，保持流动相处于良好的状态，有利于保持仪器和色谱柱的良好性能。

2、流动相变质对液相色谱分析的影响

影响流动相变质的因素主要来自光照、温度和氧化，水、缓冲盐和大部分有机相随着时间的推移都会变质，只要组成流动相的成分发生了变化，流动相的极性就发生了变化，从而导致保留时间漂移、重现性差。

3、缓冲盐的存放与更换

不少用户都很关心如何保存缓冲盐，如何延缓缓冲盐变质的过程，延长使用时间？这就需要尽量来选择棕色瓶来减少光照的影响，比如缓冲盐配多了，多配的缓冲盐要密封保存并放入冰箱冷藏，减少温度带来的影响。

如果保存得好，处于冷藏的环境下缓冲盐能保存大约一周的时间，如果保存的不好，带来的影响甚至是不可逆的，尤其是对色谱柱的影响。所以如果配缓冲盐不是很复杂，最稳妥的方法是现用现配。

4、水应何时更换

如果同一个方法中的有机相受光照的影响比较小，可用棕色瓶放水，以此减少光照的影响，建议每天都换水，至少两天换一次，比起水变质对系统和色谱柱的影响来看，还是经常换水来得更方便。

注意：若仪器长时间不开机，放水的瓶子或者管线里同样会滋生微生物，所以一定要记得要把溶剂瓶里的水换成有机相，然后开机把管线里的水置换掉。

 5、有机溶剂的稳定性

一部分常用的有机溶剂的稳定性很差，比如像四氢呋喃、氯仿和二氯甲烷等氯代溶剂，对于这种稳定性差的溶剂建议大家购买小体积包装的有机溶剂。

注意：

（1）每次取完溶剂之后，要小心把瓶盖拧紧来减少氧气的影响；

（2）对于乙腈这样比较稳定的有机溶剂，若长时间不使用仪器，要避免纯的乙腈充满整个液相系统，防止乙腈产生的聚合物对仪器有所影响。

流动相的冲洗

1、冲洗系统细节多，尤其注意缓冲盐

在开始实验之前，我们需要冲洗并稳定系统，在实验结束之后，我们也需要使用适当的溶剂冲洗并保护系统。

2、置换系统流动相需要冲洗多长时间

其实我们很难用时间准确的说明这个问题，因为冲洗时间会受流速和柱体积的影响。

所以这里建议大家用冲洗体积来计算，由于液相系统中的管线和色谱柱都比较细，流速相对比较慢，所以流动相置换的过程是比较慢的，需要5~10倍以上的系统体积才能完全置换原有的流动相（并非专业术语，仅做问题举例），所以只用知道系统体积即可。

系统体积包含仪器管线体积和色谱柱体积，比如管线体积是1ml，色谱柱的空余体积是3ml，系统体积就是4ml，用至少5倍的流动相冲洗，也就是需要20ml，10倍体积相当于40ml。有了冲洗体积，结合流速，自然就能计算出到底需要多长时间才能把体系置换好，冲洗干净，比如，流速1ml/min时，大概需要20~40分钟才能完全置换系统中原有的流动相。

以上溶剂比例，仅为举例

3、实验结束之后用什么溶剂保护体系

溶剂的选择取决于色谱柱的类型，比如反相体系，色谱柱的体系基本为C8、C18类的，甲醇和乙腈是比较合适的溶剂，只是注意乙腈不能长期保存在液相系统中，因为乙腈有聚合的问题；

若是正相体系，比如氨基柱、氰基柱等正相色谱柱，正己烷是比较合适的溶剂，如果是离子交换柱，用水冲洗体系即可。

4、如何冲洗缓冲盐

需要格外注意的是，缓冲盐在有机相中是不溶解的，所以千万不能用有机相直接冲洗缓冲盐体系，否则盐颗粒析出会堵塞管线和色谱柱，一定要有过渡。

这里建议分三个阶段冲洗缓冲盐体系：

（1）用大比例水，小比例有机相冲洗一段时间，这样可以保证顺利的冲走大部分盐；

（2）加大有机相的比例再冲洗一段时间；

（3）根据冲洗体积的计算，确保缓冲盐已经完全被置换了之后再改为100%的有机相冲洗一段时间。

来源：实验室经理人

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